一、 课题的来源:本项目来源于国家自然科学基金"狂犬病病毒结构与功能关系的研究（31172322）"、广东省产学研重点项目"高免疫原性狂犬病基因工程灭活疫苗的研制及中试（2010A090200083）"和农业部农业公益性行业专项"狂犬病灭活疫苗（dG）的研制、产业化及流行病学调查（201103032）"。
   二、 研究的目的和意义:我国，动物狂犬病的防制工作比较落后，多年来一直采取提高注册费用、行政灭犬辅以免疫接种的措施。这些措施在相当长的时间内取得了一的效果。但随着人们生活水平的提高、人们对个性化生活追求的强烈，以往成功的灭犬措施已大打折扣，近年来狂犬病个案的快速增长就是明显的佐证。因此，结合狂犬病的流行趋势，开展狂犬病致病机理的研究，研制抗原性强、毒力弱、繁殖效率高具有自主知识产权的狂犬病疫苗，是防治人类狂犬病的重要措施之一，具有重要理论和公共卫生意义。
   三、 主要论点与论据:

   1.为了解广东省狂犬病病毒（RABV）街毒的特性，我们从患狂犬病的猪脑中分离获得一株狂犬病病毒街毒（GD-SH-01）, 研究发现该猪源狂犬病病毒可在NA和BHK-21细胞中繁殖，不仅可致乳鼠发病死亡，还能致成鼠发病。序列分析表明，该毒株的基因具有街毒的典型特征，其致病指数强于标准攻击病毒 CVS-24，更特别的是47个碱基独一无二。为了探索狂犬病病毒街毒的致病机理，在充分了解GD-SH-01分子特征的基础上，我们构建了RABV GD-SH-01的全长基因组cDNA克隆，并拯救获得具完全生物学活性的RABV。以此为起点，我们进行了强毒和弱毒单基因的替换，拯救获得多个嵌合RABV，继而发现弱毒RABV的N和L基因被GD-SH-01的N、L基因替换后，嵌合病毒rHEP-shN 和 rHEP-shL的繁殖能力更强， 与之相反，P基因被替换，嵌合病毒rHEP-shP的繁殖、滴度和扩散能力均有所下降。据此，我们建立了狂犬病病毒强毒GD-SH-01的反向遗传操作系统。

   2.众所周知，病毒感染细胞后，细胞往往出现凋亡和自噬，继而对机体产生损伤并出现临床症状。为了明确狂犬病病毒是否能够诱导细胞自噬和凋亡，我们选择生物学特性截然不同的两株狂犬病病毒：强毒株GD-SH-01和弱毒株HEP-Flury病毒，通过将两株病毒感染SK和NA细胞病对其进行western-blot检测、电镜观察以及GFP-LC3B质粒转染并观察GFP荧光点分布，我们发现狂犬病病毒强毒株GD-SH-01株病毒可以诱导明显的细胞自噬。再通过强弱毒基因的替换，我们还发现RABV的M基因在细胞自噬过程中发挥了重要作用。通过P基因的替换，我们发现P基因在RABV诱导的细胞凋亡中举足轻重。信号通路研究发现，GD-SH-01和rHEP-shP感染细胞后，抑制了促凋亡蛋白Bax的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而使线粒体膜电位降低，线粒体内的细胞色素c释放进入细胞质，细胞色素c连同Apaf-1与pro-Caspase-9形成复合体并同时激活Caspase-9，激活的Caspase-9进一步激活了Caspase-3，后者剪切底物PRAP，最终导致细胞凋亡的发生。据此，我们证实，RABV诱导的细胞凋亡是由于内源性凋亡通路被激活。
   3.为探索基因重排对狂犬病病毒致病性、免疫原性的影响，我们将狂犬病病毒HEP-Flury的P基因从野生型的第二位移至第一、三和四位，拯救获得相应的病毒。研究发现，病毒的复制效率与N蛋白的表达量呈正相关，而N蛋白的表达受P基因的调控。病毒对乳鼠的致死与P基因mRNA在一个复制周期中的比例有关。病毒诱导细胞凋亡和在细胞中的扩散能力与不但与病毒各基因的复制比率有关，而且与各基因的位置有关。
   4.了提高疫苗的免疫效力，我们拯救获得了携带犬α干扰素（CaIFNα1）和白介素6 (CaIIL6)的两株重组RABV，并对它们提升疫苗免疫效果进行了研究。结果显示，CaIFNα1和CaIIL6的过表达降低了重组狂犬病病毒rHEP-CaIFNα1和rHEP-CaIL6的毒力，能更早诱导RABV的中和抗体。而免疫后小鼠的强毒攻击试验则进一步表明重组狂犬病病毒rHEP-CaIFNα1和rHEP-CaIL6可在较小剂量下，激发比亲本HEP-Flury株更强的免疫保护力。通过荧光定量检测免疫小鼠接种部位各时间点的免疫相关因子的转录水平，发现重组狂犬病病毒rHEP-CaIFNα1在小鼠体内更早更高效地诱导了机体的干扰素相关的抗病毒应答；流式细胞术对免疫小鼠淋巴结、外周血细胞的流式免疫分型分析结果也说明了表达CaIFNα1的重组病毒可更快更有效地活化机体的细胞免疫应答。 犬源IL-6的过表使淋巴结富集了更多的成熟B淋巴细胞和CD8+ T淋巴细胞，在中枢神经系统诱导了更强的炎症和免疫反应。因此，我们的实验证实，犬α干扰素和白介素6 是非常高效的狂犬病疫苗免疫佐剂。
   5.为了解决我国狂犬病灭活疫苗长期依赖进口的弊端，我们拯救获得了携带双糖蛋白（G）基因的重组狂犬病病毒（HEP-Flury-dG株），并对该重组病毒的生物学特性进行了研究。结果发现，该病毒完全适应BHK-21细胞，能在该细胞上大量稳定增殖（狂犬病灭活疫苗生产过程中碰到的最大问题是病毒滴度低，因此需要浓缩和纯化。该毒株已化解了该难题）。在BHK-21细胞中培养3日，病毒滴度不低于1.0×108FFU/ml，是亲代毒株HEP-Flury的10~100倍。该病毒还具有很好的免疫原性，其诱导犬只产生抗体的能力是亲代毒株的1.5倍。因此，以该病毒为种毒，我们首次成功研发了一款狂犬病灭活疫苗（dG株）并获农业部新兽药证书（(2016)新兽药证字25号）。目前该疫苗已在国内推广应用，获得了较大的经济效益和社会效益。
   四、 创新:
   1.将从广东省分离的狂犬病街毒进行了系统分析，还发现了独一无二的47个碱基，具有生物材料的原创性。
   2. 以该分离病毒为模式毒株，建立了可工作的狂犬病强毒株的反向遗传技术平台，为病毒致病机理的研究奠定了基础，因此技术上有所创新。
   3. 以该技术平台为基础，发现狂犬病病毒可诱导细胞自噬，并且M基因发挥了至关重要的作；发现狂犬病病毒强毒也能诱导细胞凋亡，并且证实P基因致关重要，凋亡过程激活了内源性通路，该成果具理论创新。
   4. 发现狂犬病病毒基因的位置并非固定不变，尽管P基因在病毒核蛋白体的构成和依赖RNA的RNA聚合酶中至关重要，但其位置仍可向前向后移动，该成果也具理论创新。
   5. 发现犬α干扰素和白介素6分别嵌入狂犬病病毒基因后，能大大提高病毒的免疫原性。拯救获得携带双糖蛋白基因的重组狂犬病病毒，并获政府注册的双G狂犬病灭活疫苗，具成果创新。
   五、 社会经济效益:
   1. 狂犬病病毒街毒的分离、培养、鉴定和基因分析，经与国内外其它街毒及人和兽用疫苗株的比效，发现其仍为经典毒株（Classic），可被目前疫苗所产生的抗体中和，因此以经典毒株制备的疫苗可控制该病毒的流行。
   2. 建立的强毒反向遗传技术平台，与之前建立的弱毒反向遗传技术平台交替使用，有助于阐明狂犬病病毒的致病机理。而狂犬病强毒诱导自噬和细胞凋亡的发现，更进一步解析了狂犬病毒所致脑部细胞损伤的机理。
   3. P基因的重排为狂犬病病毒基因功能的研究开辟了一条新路经，同时也是构建理想疫苗病毒的好方法。
   4. 狂犬病病毒与犬α干扰素和白介素6共培养，大大提升了病毒的免疫力，为狂犬病疫苗的应用找到了一类好的免疫佐剂。
   5. 狂犬病灭活疫苗（dG株）的成功注册、生产和大面积推广，为疫苗企业创造了经济效，更重的是因疫苗的施用，减少了动物狂犬病的流行，为人居提供了安全的居住环境。
   经济效益：自该项目启动以来，用狂犬病灭活疫苗（dG株）免疫比格犬6139只、宠物犬3919只、中华田园犬1565680只。这些犬只因注射了狂犬病灭活疫苗，未发现因感染狂犬病病毒而死亡，未给企业和家庭造成经济损失，但疫苗生产企业获得收入。 
   社会效益：人间狂犬病仍是我国重要的公共安全问题，近几年来，我国因狂犬病而死亡的人数徘徊在每年1000例左右，而被犬咬伤而施以全程疫苗和免疫血清的人数超过10万人次，每年因之国家和家庭付出的财政负担超过100亿人民币。据统计，96%的人间狂犬病来自犬咬伤。因此，有效控制犬只狂犬病是预防人间狂犬病的重要举措。上述企业、家庭的犬只注射狂犬病灭活疫苗（dG株）后，未发现犬只因感染狂犬病病毒而发生狂犬病，应用疫苗的区域也未发生犬只狂犬病的流行。因此，应用该疫苗后，大大降低了与犬接触的人发生狂犬病的风险，为十九届三中全会提出全面振兴乡村计划作出了贡献。
   六、 存在的问题:但是，我们在成果推广中也碰到不少问题。一是多年来城市宠物犬主要依赖进口灭活疫苗，对国产疫苗有天然的排斥；二是动物狂犬病免疫法规尚不完善，基层兽医部门在实操过程无法可依；三是我省大部分的犬只分布在狂犬病知识普及较欠缺的广大农村，狂犬病疫苗免疫的自觉意识有待唤醒。