急性心肌梗死的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，导致社会、家庭负担加重，是医疗机构心血管科面临的主要临床问题。本课题组为研究心肌梗死的发病机制，以"急性心肌梗死内质网应激的影响及机制"立项，并得到广东省自然科学基金委员会的资助。
   1.本项目在整体水平研究心肌梗塞时心肌细胞的凋亡、ERS情况及JNK、NF-κB、MMP2、MMP9、CRT等在心肌梗塞组和假手术对照组心肌细胞中的差异。1.1实验分组并制作急性心肌梗死模型16只成年雄性APA仓鼠，随机分为两组（n=8）：手术组、假手术组。手术组术前禁食12h，自由饮水，以2％戊巴比妥钠（2.3ml/kg）腹腔注射麻醉后固定于鼠台，气管插管，连接微型动物呼吸机支持呼吸。开胸后结扎左冠状动脉前降支制作急性心肌梗死模型。假手术组开胸后穿线但不结扎。1.2 超声心动图了解心肌梗塞后心腔大小、心脏功能的改变，观察指标包括室间隔( IVS)、左室舒张末内径(LVDd)、左室收缩末内径(LVD s)、左室后壁( PW )、短轴缩短率( FS)、射血分数( EF)等。并取左室长轴切面行M 型心脏超声检查。1.3 取活体心脏组织制片切片染色后，用HMAIS－2000多媒体彩色病理图文分析系统分析心肌梗塞面积。1.4 TUNEL法检测心肌梗塞时心肌细胞的凋亡情况。梗塞区心肌细胞凋亡TUNEL法的测定：取心脑缺血区组织,福尔马林溶液内固定、石蜡包埋。脱蜡水化、通过TUN EL 反应混合液(A 液与B液按1:9混合) Mayer 苏木素复染细胞核;检测TUN EL 阳性反应。根据下列标准确定着色阳性细胞为凋亡细胞: ①单个散在分布; ②细胞变圆或不规则,与邻近细胞的连接消失,呈空晕状,染色质浓缩聚集呈圆形或紧贴核膜边缘成新月状，细胞核碎裂等; ③周围无炎症反应。1.5 依试剂盒说明提取各组相应心肌组织内RNA,用Real-time RT-PCR法检测各组间calreticulin，GRP78，JNK，c-jun，c-fos，NF-κB等mRNA的水平。1.6 依试剂盒说明提取各组相应心肌组织内总蛋白，用Western blot法检测各组间calreticulin，GRP78，JNK，P-JNK，c-jun，p-c-jun，c-fos，p-c-fos，NF-κB等蛋白的表达。1.7 原位Zymography法检测各组间MMP2/9活性的差异。

   2.本项目在细胞水平研究缺氧时心肌细胞的凋亡情况、ERS情况和JNK、NF-κB、MMP2、MMP9、CRT等在正常对照组、缺氧组、氧化应激组，及JNK抑制剂、NF-κB抑制剂处理组中的差异，依据实验数据分析可能参与其中的信号通路。2.1 H9C2心肌细胞系的培养用含10℅新生牛血清的DMEM培养液于37℃、5％CO2孵箱中培养至对数生长期，进行传代。将H9C2细胞按1×106cells/bottle的浓度接种于250ml培养瓶，置CO2孵箱常规培养24h,换无血清DMEM培养液同步化24h后，随机分为以下7组：（1）正常对照（C）组:细胞置CO2孵箱37℃常规培养至实验结束；（２）缺氧（Ｈ）组：细胞置于缺氧仓（通入气体为95％N2-5％CO2）内2h，结束实验；（３）氧化应激（Ｈ２０２）组：培养基中加入Ｈ２０２，终浓度为200umol/L, 37℃孵育2h结束实验；（４）SP600125+H组：培养基中加入JNK抑制剂SP600125，37℃预孵育10min后，按照（２）操作；（５）SP600125+Ｈ２０２组：培养基中加入JNK抑制剂SP600125，37℃预孵育10min后，按照（3）操作；（６）PDTC+H组：培养基中加入NF-κB抑制剂PDTC，37℃预孵育10min后，按照（２）操作；（7）PDTC+Ｈ２０２组：培养基中加入NF-κB抑制剂PDTC，37℃预孵育10min后，按照（3）操作。2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡各组细胞经胰酶消化收集后离心，按照试剂盒说明书进行流式分析，测定各组细胞凋亡情况。2.3依试剂盒说明提取各组细胞内RNA，用Real-time RT-PCR法检测各组间calreticulin，GRP78，JNK，c-jun，c-fos，NF-κB等mRNA水平。2.4 依试剂盒说明提取各组细胞内总蛋白，用Western blot法检测各组间calreticulin，GRP78，JNK，P-JNK，c-jun，p-c-jun，c-fos，p-c-fos，NF-κB等蛋白的表达，用Zymography法检测各组间MMP2/9活性的差异。
    本项目以APA 仓鼠心肌梗死模型及H9C2 心肌细胞为研究对象，以心肌细胞凋亡、钙网蛋白表达、MMP2 和MMP9 mRNA 及活性变化作为切入点，通过完整的分子生物学实验手段，验证心肌细胞在急性缺血缺氧条件下，内质网应激通过JNK 以及NF-κB 信号转导系统及其下游通路影响MMP2 及MMP9 表达，从而调节心肌细胞间质蛋白的含量，影响心脏的结构及功能这一"假说"，探索内质网应激导致MMP2 和MMP9活性变化的机制，为进一步阐明急性心肌梗死后心室重构的发生、发展提供新线索和依据，实现"由基础到临床"的成果转化。
    目前，MMP2和MMP9被激活为有活性的MMP2和MMP9的机制至今仍未完全阐明。我们的团队探讨了引起钙网蛋白基因缺失（crt-/-）胚胎成纤维细胞中MMP2和MMP9变化的机制，研究发现PI3K、JNK、NF-κB等细胞通路参与了钙网蛋白基因缺陷细胞中MMP2和MMP9活性的调节。
    该项目研究内容具有较高的理论意义和应用前景，研究思路清晰科学，研究方法切实可行，具有一定的创新性。