①课题来源与背景：本课题来源于广东省科学技术厅广东省科技计划项目，课题名称：锦鲤疱疹病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立及初步应用 ，课题编号2012B020308012，经费实际投入额为5万元，全部由省级投入。 背景：锦鲤疱疹病毒病(Koi herpesvirus disease， KHVD) 是由锦鲤疱疹病毒（KoiHerpesvirus， KHV）引起的一种烈性传染病， 属二类动物疫病， 是进口锦鲤（Cyprinuscarpio koi）、鲤（Cyprinus carpio capio）的必检项目，可造成患病锦鲤、鲤 80％-100％的死亡率， 严重威胁锦鲤、鲤养殖业安全。自 1996 年爆发至今， KHVD 已经在日本、东南亚等世界各地广泛流行（Bergmann， 2010）。 2002 年广东省在大陆地区爆发了第一次 KHVD 疫情， 近年来中山、江门、广州等地均有疫情发生。广东省是锦鲤养殖大省，仅江门市锦鲤产值就超过 1.8 亿元，鲤又是广泛养殖的大宗淡水鱼类，国内锦鲤市场的繁荣以及与日本、东南亚等国家的锦鲤贸易，给我省 KHVD的防控带来巨大压力。抗原捕获 ELISA 检测技术作为一种高通量检测方法，广泛应用于畜禽病原检测。基于多抗血清的免疫学检测方法在特异性方面存在不足，而单克隆抗体的抗原捕获 ELISA 检测方法具有高特异性、高通量、低成本、灵敏、快速等优点，可以检测分泌物、粪便等样品，因此更适用于检测价格昂贵的高端锦鲤。

     ②技术原理及性能指标：课题组制备了抗 KHV 单克隆抗体并且初步制备了抗 KHV 全病毒的鸡卵黄抗体；单克隆抗体的特点是具有较好的特异性，鸡卵黄抗体则易于大规模制备，成本较低，还具有较好的稳定性，本项目拟采用上述两种抗体分别作为捕获抗体和检测抗体， 优化反应条件，建立 KHV 抗原捕获 ELISA 检测方法；并从特异性、敏感性、重复性、符合性，以及抗体包被板保存期等方面系统评价该检测方法。

     ③技术的创造性与先进性：具有高特异性、高通量、低成本、灵敏、快速等优点，可以检测分泌物、粪便等样品，更适用于检测价格昂贵的高端锦鲤。该方法与现有的 PCR 技术联合使用，极大提高 KHV 病原检测的准确性，为 KHVD 的防控提供有力的技术保障。该方法的建立及应用，有助于防控KHVD 的蔓延，保障鲤、锦鲤养殖业安全，将会产生显著的社会效益和经济效益。

     ④技术的成熟程度，适用范围和安全性：抗原捕获 ELISA 检测方法的适检样品广泛，可以检测分泌物、粪便等样品，避免了核酸检测等方法在取样过程中对鱼体的损伤，在国内高端锦鲤单尾价格普遍超过 1 万元的情况下，具有更大的推广价值。该技术可以应用于口岸检疫、流行病学调查等领域的 KHV 抗原捕获ELISA 检测方法， 为防控 KHV 传播以及确保锦鲤、 鲤的养殖业安全提供技术支持。

      ⑤应用情况及存在的问题：应用本项目建立的抗原捕获 ELISA 技术对广东 10 家养殖场的临床样品进行了检测，初步掌握了 KHV 在广东地区的流行情况， 并对流行毒株的基因型、 起源、 进化等情况做了初步分析。这为进一步监测病毒的传播情况， 以及后续诊断、防治方法的建立提供理论依据。目前存在的问题主要是，建立的抗原捕获 ELISA 方法的临床应用有待于进一步加强。由于经费紧张，临床样品检测仅完成了合同规定的数量。在今后的研究中，有必要在 KHVD 发病季节扩大采样规模，尤其是加强对芳村花鸟鱼虫市场上锦鲤的检测，以进一步掌握广东地区的 KHV 流行情况。

    ⑥历年获奖情况：无