课题来源与背景： 广东省科技计划项目：基于shRNAi技术改造细胞系及其在高效生产猪流行性腹泻病毒疫苗中的应用（项目编号：2015A020209081，执行期为:2015-04-01至 2017-03-31），来源于广东省科技厅的资助，总资助金额为15万。该项目以危害养猪业的猪流行性腹泻疾病为研究对象，针对近年来临床上常用的PED灭活和弱毒疫苗对该病的免疫效果并不十分理想这一问题，利用RNA干扰技术定向改造细胞系，以期获得高效增殖PEDV的细胞株。

     研究目的与意义： 猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的猪的急性、高度接触性肠道传染病。PED对猪的危害性很大，对哺乳仔猪的危害最为严重。自2010年PEDV新型毒株出现后，临床上常用的PED灭活和弱毒疫苗对该病的免疫效果并不十分理想，因而，PED仍然存在于猪场并反复发生，这给养猪业的健康发展造成了严重危害。现有研究表明，目前我国流行的PEDV毒株为新的基因型，且呈多型化衍化，由于基因的遗传变异，现有的疫苗很难起到有效的防控。同时，由于PEDV适应细胞困难、增殖滴度低等特点，严重阻碍了新型高效疫苗的制备，给该病的预防带来很大的困难。因此，培育、筛选出有利于PEDV有效增殖、分离驯化的易感细胞，不仅是解决PEDV培养的问题，更有利于PEDV疫苗的研发，而且为工业化细胞培养生产疫苗，提高疫苗质量，降低疫苗成本奠定了基础。

    主要论点与论据： RNAi（RNA interference，RNAi）是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的一种基因阻断技术。因此，利用RNA干扰技术定向改造细胞，是筛选PEDV易感细胞的有利方法。已有研究表明，水泡性口炎病毒在p53-/-细胞里复制的病毒滴度是正常细胞的30倍。Turpin 等（2005）研究表明，在p53 knock down的细胞中，流感病毒的滴度明显增加。Narayan Dharel等(2008)研究发现p53 knock down细胞中丙型肝炎病毒RNA的复制和病毒蛋白的表达显著提高。另有研究者发现，TGEV通过激活p53通路，诱导PK-15和ST细胞停滞在S和G2/M期，并且TGEV在S期和G2/M期同步化的细胞中的滴度高于G0/G1期同步化或非同步化的细胞中的滴度。因此，本研究尝试用CRISPR技术对Vero E6细胞的p53基因进行knock out，实现对Vero E6细胞的改造，以期获得高效增殖PEDV临床野毒的细胞株。

    创见与创新： 本研究根据合同书的内容，首先尝试用CRISPR技术对Vero E6细胞的p53基因进行knock out，实现对Vero E6细胞的改造，但实验结果发现，knock out Vero E6细胞的p53基因，不利于Vero E6细胞的生长， knock out p53基因的Vero E6细胞株，在形成单克隆后，继续扩大培养过程中，细胞停止生长，最终细胞裂解死亡。因此，我们又采用RNA干扰技术，对Vero E6细胞的p53基因进行knock down，以期改变Vero E6细胞周期，筛选出有效增殖PEDV的Vero E6细胞株，为体外培养PEDV提供了一个改良的细胞株，为大规模生产PEDV疫苗提供了一个可靠的备选细胞株。对照合同书内容完成了针对p53基因的有效siRNA筛选，并构建了相应的RNAi质粒，通过细胞转染和G418筛选获得了稳定细胞株 — p53-Vero E6细胞；优化了PEDV的Real-time PCR检测方法，并且分析发现，PEDV在改造后的Vero E6-p53细胞株中的病毒拷贝数与Vero E6细胞株相比有所增加。

    社会经济效益，存在的问题： 近年来，PED在猪场反复发生，给养猪业的健康发展造成了严重危害。目前，临床上 缺乏有效防控临床PEDV野毒的疫苗，因此，本项目对适应PEDV野毒生长增殖的细胞系的改造，不仅有利于PEDV感染导致猪体发病机制的研究，对PED疫苗的研发以及防控更具有重要意义。值得注意的问题是，该项目完成实施后，需进行PEDV临床流行毒株在筛选获得的细胞株上的增殖条件优化，以期为将来PEDV疫苗的研发奠定基础，降低PEDV细胞毒疫苗的生产成本，获得高产量的PEDV细胞毒疫苗。

    历年获奖情况： 目前已发表SCI文章一篇，中文核心期刊两篇。培养副研究员两名：沈海燕（兽医副研究员，证号：粤高职证字第1600101003570号，2016年3月9日），张建峰（兽医副研究员，证号：粤高职证字第1600101003593号，2016年3月9日）。