1.课题来源与背景：广东省科技计划项目——工业高新技术领域：基于shRNAi 和受体稳定表达技术的细胞系改造及其在PEDV疫苗研发中的应用（项目编号：2014A010107022，执行期：2015.01.01——2017.12.31），总经费30万，课题经费来源于广东省财政厅。该项目以危害养猪业的猪流行性腹泻疾病为研究对象，针对近年来PEDV临床上常用的PED灭活和弱毒疫苗对该病的免疫效果并不十分理想这一问题，利用RNA干扰技术和受体表达技术定向改造细胞系，以期筛选出适合PEDV高效增殖的高度敏感重组细胞系。

    2. 研究目的与意义：猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）自2010年出现了新型毒株，临床上常用的PED灭活和弱毒疫苗对该病的免疫效果并不十分理想。因此，本研究筛选出有利于PEDV有效增殖、分离驯化的易感细胞，不仅是解决PEDV培养的问题，更有利于PEDV疫苗的研发，而且为工业化细胞培养生产疫苗，提高疫苗质量，降低疫苗成本奠定了基础。

    3.主要论点与论据：本研究运用RNA干扰和受体稳定表达等分子生物学技术和细胞培养技术筛选易于PEDV高效增殖的细胞系，为临床开发高效的PEDV疫苗奠定基础。首先，设计针对p53基因的有效shRNA并构建RNAi质粒；将质粒转染ST细胞48小时后，通过Real-time PCR方法筛选干扰效率最高的RNAi质粒；进而以此RNAi质粒转染ST细胞，通过G418筛选阳性细胞；然后以real-time PCR方法和western blot方法，分别在分子水平和蛋白水平分析了shRNA干扰p53的效果，结果发现，p53基因的mRNA和蛋白表达量均受到了抑制，获得了p53 knock-down的稳定细胞系ST-p53；流式细胞术分析ST-p53细胞的细胞周期，结果发现，ST-p53细胞的S期延长，细胞增殖加快；MTT法测定ST-p53细胞的生长曲线，与ST细胞相比，ST-p53细胞生长较快，说明p53表达的降低可以加快ST细胞的生长；对ST-p53细胞连续传代，并保存每代细胞系，分析发现ST-p53细胞具有稳定性；最后，我们用PEDV分别感染ST-p53细胞和ST细胞，感染48h后，经SYBR Green I相对荧光定量PCR分析发现，与ST细胞组相比，PEDV N基因的mRNA表达在ST-p53细胞中有所提高。另外，我们还克隆了猪PEDV感染细胞的受体基因APN（2992bp），将其连接入PIRESpuro2真核表达载体，通过嘌呤霉素加压筛选，获得了高效稳定表达PEDV受体基因的细胞系ST-pAPN，为病毒的滴度提高积累了条件。

    4. 创见与创新：本研究利用RNA干扰技术和受体表达技术定向改造细胞系，通过RNA干扰相应的细胞因子，从而改变细胞的生长周期，延长PEDV在细胞中生长的特定时期，进而在有效的细胞周期内使PEDV的增殖量达到最高。另一方面，通过构建受体稳定表达的重组细胞株，筛选出适合PEDV高效增殖的高度敏感重组细胞系（ST）

    5.社会经济效益，存在的问题： 细胞疫苗是未来动物疫苗研发及应用的主导方向，如何在有限数量的细胞中提高病毒滴度，降低成本，是制约动物疫苗生产的关键技术瓶颈之一。在动物疫苗生产过程中高效增殖病毒的细胞株是最重要的条件。本课题通过RNAi技术改造ST细胞，以及受体稳定表达技术培养ST细胞株，以期达到高效增殖PEDV，提高病毒滴度的目的，为未来PEDV细胞疫苗的生产提供有力保障。

     6. 历年获奖情况： 目前授权发明专利1件： 张建峰，沈海燕，张春红，郭鹏举，陈琴苓，卢宇. 靶向IFNAR2基因的RNA干扰表达载体构建及应用，专利号：ZL201410203742.4） 在中文核心期刊发表文章2篇： [1] 沈海燕, 张春红, 刘志成, 孙俊颖, 卢宇, 张建峰. p53基因RNA干扰载体的构建及其在ST细胞系的稳定表达. 中国兽医科学, 2016, 46(8): 979- 985. [2] 沈海燕, 张春红, 刘志成, 孙俊颍, 卢宇, 张建峰. RNA干扰抑制ST细胞I型干扰素受体-2表达的研究. 动物医学进展, 2016, 37(9): 52-56. 7. 成果简介可向社会公开，不涉及商业秘密内容。