1. 课题来源与背景：本项目广东省科学技术厅公益研究与能力建设专项资金资助，项目名称：利用CRISPR/Cas9系统构建抗残翅病毒的转基因意大利蜜蜂，编号：2014A020208074.课题背景：蜜蜂是人类食物链上最重要的一环。蜜蜂为农作物授粉而产生的价值是蜂产品本身价值的143倍。然而，蜜蜂无可避免的遭受多种病原体的感染而导致群体消亡，目前报道的病毒就有18种之多，其中残翅病毒（Deformed wing virus）是危害意大利蜜蜂较为严重的一种。现有治理方法严重依赖化学药剂，但也受抗性和污染问题困扰。因此，粮食生产系统的可持续性发展，亟需抗病毒蜜蜂的培育。CRISPR-Cas9系统，被称为第三代基因编辑技术。相比于ZFN系统和TALEN系统，具有更快速、便宜、特异性高的特点。CRISPR/Cas系统是细菌中的一种免疫保护机制，该系统可以介导外源DNA及RNA的降解。在细菌、斑马鱼、家蚕等中有成功报道。具有多年饲养蜜蜂和蜂产品研发的基础。在蜜蜂相关研究工作中，申请人所在单位业已完成了广州市科技投标项目“蜜蜂产品无公害标准化生产规程”和广东省科技项目“利用环境友好型技术防治蜜蜂害螨的研究和示范”项目。实验室在广州等地建立了多个实验养蜂场，为项目的实施提供了坚实的条件支撑。

    2. 技术原理及性能指标：CRISPR基因编辑系统被称为第三代基因编辑技术。主要由CRISPR基因座及Cas蛋白两个部分组成。其中CRISPR基因座是由1个前导区 (Leader) 、多个高度保守的重复序列 (Repeat) 和变异较大的重复间隔序列。其作用过程可分为三个步骤：（1）识别外源基因；（2）形成crRNAs；（3）干扰目的基因，成熟的crRNA引导Cas蛋白到达靶位置，目的基因序列被Cas蛋白切割，产生双链断裂的DNA片段，通过同源重组将外源DNA片段精准整合到靶细胞基因组中。CRISPR/Cas9系统因其设计简单、耗时短、实验可操作性强、成本低等优点已经成为目前实验室常规的基因编辑技术。

     3. 技术的创造性与先进性：CRISPR-Cas9 系统，相比于ZFN 系统和TALEN 系统，具有更快速、便宜、特异性高的特点。首先，CRISPR-Cas9 系统的可用位置更多。理论上基因组中每8 个碱基就能找到一个可以用CRISPR-Cas9 进行编辑的位置，可以说这一技术能对任一基因进行操作，而TALEN 和ZFN 系统则在数百甚至上千个碱基中才能找到一个可用位点，这大大限制了使用范围。其次，CRISPR-Cas9 系统更具有可拓展性，例如可以通过对Cas9 蛋白的修饰，让它不切断DNA 双链，而只是切开单链，这样可以大大降低切开双链后带来的非同源末端连接造成的染色体变异风险。此外还可以将Cas9 蛋白连接其他功能蛋白，来在特定DNA 序列上研究这些蛋白对细胞的影响。第三，更为重要的是，CRISPR-Cas9 系统的使用极为方便，只需要简单的几步就能完成，几乎任何实验室都可以开展工作，而不需要向ZFN 和TALEN 那样借助商业公司的协助完成。

     4. 技术的成熟程度，适用范围和安全性：CRISPR/Cas系统作为第三代基因编辑技术，具有简便、可操作性强、拓展性强等特点，主要技术风险有：在果蝇和家蚕中已成功报道，但蜜蜂的社会昆虫特性使得在操作过程中需要进行修改。

     5. 应用情况及存在的问题：还未成功应用，因为蜜蜂生物学特性很难获得纯培养的转基因后代。

     6. 历年获奖情况：无。