课题类型: 国家自然科学基金重点项目 课题来源单位: 国家自然科学基金委员会 课题名称: 干细胞源性神经网络支架移植修复脊髓受损伤神经网络的机制研究 课题编号:81330028 课题实际经费: 280万元 课题实际完成时间: 2014年～2018年

    课题背景： 研究已经表明，脊髓损伤处的微环境不利于其自身重建神经网络。因此要设法改善脊髓损伤处的微环境，重新建立新的神经环路。为此，本课题应用过表达神经营养素-3(NT-3)的雪旺细胞，在明胶海绵支架中作用过表达TrkC的成体干细胞形成功能性神经网络组织；再将这种干细胞源性神经元形成的神经网络整合到受损伤脊髓的神经网络中，让干细胞源性神经元与宿主脊髓神经元之间建立联系，以及宿主再生神经纤维与移植的干细胞源性神经元之间建立联系，在脊髓内起到修复受损伤的上下行神经传导通路的中继器作用，恢复脊髓自主运动功能。

    研究目的与意义： 本研究应用神经营养因子基因修饰、干细胞分化、人工组织构建以及分子生物学、神经电生理学和神经解剖学检测等现代再生医学技术，研究出具有突触传递功能的干细胞源性神经网络组织和类脊髓组织，并用于修复脊髓受损伤神经网络的研究中；阐明构建功能性神经网络组织和类脊髓组织的机制，及其移植在全横断脊髓损伤处与宿主神经元之间建立突触联系、修复脊髓自主运动功能的机制。本研究不仅对神经网络组织潜在的临床应用提供新思路，而且为大动物脊髓损伤后的病理生理学变化提供新认识，也为脊髓损伤病人恢复基本的运动功能带来新希望。

     主要论点和论据： 1.在体外开展构建具有功能的神经干细胞(NSCs)性神经网络组织(或类脊髓组织)的研究 研究结果显示，体外培养的NSC源性神经元可长出轴突到类白质，被少突胶质细胞包绕形成有髓鞘的轴突。类灰质神经元之间形成突触结构。应用膜片钳技术可诱发神经元产生动作电位，可记录到兴奋性突触后电流和抑制性突触后电流。研究结果表明，在体外采用生物支架、神经营养因子及其受体和NSCs分化等技术可构建一种具有突触传递功能的类脊髓样组织。 2.在体外探讨TrkC基因修饰的NSCs在神经网络组织内分化为具有生理功能的神经元的机制 (1)研究结果表明，在明胶海绵支架内NT-3与TrkC作用可通过激活PI3K/AKT/mTOR或PI3K/AKT/CREB通路促进NSC源性神经元形成突触结构。 (2)研究结果显示，应用膜片钳技术可记录到单独培养的类灰质内NSC源性神经元的动作电位，但不能诱发出连续动作电位；将类灰质部分和类白质部分共培养后则可诱发出连续动作电位。研究结果表明，类脊髓灰质和类脊髓白质共培养后神经元电生理功能更完善。 (3)研究结果表明，类脊髓灰质和类脊髓白质共培养后能够促使神经元之间通过突触结构传递兴奋性或抑制性神经信息。 3.体外研究LINGO-1促进神经元凋亡的机制及LINGO-1的敲减促进大鼠全横断脊髓损伤区移植细胞的存活 (1)研究结果表明，LINGO-1可与TrkC相互结合，抑制TrkC磷酸化，并通过抑制PI3K/Akt信号通路，最终引起神经元凋亡。 (2)研究结果表明，当移植敲减LINGO-1的NSC源性神经网络组织到大鼠全横断脊髓损伤区后8周，在脊髓损伤/移植区NSC源性神经网络组织中的细胞存活增加，大鼠皮质运动诱发电位的传导和瘫痪肢体的运动功能得到改善。 4.在体内联合应用NSC神经网络组织移植、督脉电针和LINGO-1拮抗剂修复脊髓受损伤神经网络的研究 (1)研究结果表明，移植的NSC源性神经网络组织能够整合到脊髓受损伤神经网络中，与上、下行再生神经纤维建立突触联系，以神经元中继器方式传递起神经信息。 (2)研究结果表明，类脊髓组织移植到脊髓损伤处能够整合到宿主脊髓神经网络中，通过类灰质内神经元起中继器作用，借助类白质内少突胶质细胞对再生神经纤维的髓鞘化作用，共同促进大鼠受损伤脊髓的运动功能恢复。 (3)研究结果表明，督脉电针联合NSC源性神经网络组织移植可以提高受损伤脊髓内NT-3的水平，并激活移植神经网络组织或宿主的神经元内NT-3-TrkC信号通路，从而促进移植神经网络组织以及宿主的神经元存活，有利于NSC源性神经网络组织神经元与受损伤脊髓宿主神经元重建连接，改善受损伤脊髓的运动功能。 (4)研究结果表明，在LINGO-1敲除小鼠全横断脊髓损伤处移植LINGO-1敲除的神经网络组织细胞，其存活数量则显著增多。

    创见与创新： 本研究模拟脊髓具有传导神经信息的结构和功能特点，联合应用神经营养因子及其受体、成体组织干细胞和生物材料等组织工程新技术，构建一种具有突触传递功能的外源性神经网络组织或类脊髓组织，然后将它移植到全横断脊髓损伤处，改善受损伤组织微环境，起到修复神经传导通路的神经元中继器作用，接收上、下行神经信息，并将神经信息传递给损伤处两侧断端的宿主神经元，改善脊髓自主运动和感觉功能。

    社会经济效益，存在的问题： 本项目研究内容在Biomatrial、 Advanced Science、 advanced Functional Materials等重要国际学术刊物上发表多篇论文，获授权发明专利2项，培养博士生5名和硕士生5名。本项目研究成果具有临床转化前景。 获奖情况： 2017年，曾园山、丁英、阮经文、刘洲、李文杰、张可、陈雅云、曾湘、李晓滨、李淑敏，“督脉经穴电针通过NT-3介导移植的成体干细胞修复脊髓损伤的研究”，获广东省自然科学奖二等奖。