1. 课题来源与背景： 1.1 课题来源 课题类型:广东省科技计划项目（地方计划） 课题来源单位：广东省科学技术厅 课题名称：实验猴结核病分子诊断标志物筛选研究 课题编号：2013B020307005 1.2 课题背景 核病是己知最古老的疾病之一，被国际兽疫局（OIE）列为B类传染病。由于实验猴结核病的病原与人类结核病相同，增加了接触人群感染结核病的风险，加之实验猴对结核病十分敏感，更增加了实验猴对结核病在人与动物和动物间的传播。 目前实验猴结核病最常用的诊断方法是结核菌素试验，该方法受到多方面因素的影响（如结核菌素的种类、剂量、接种部位等），存在反复试验耐受现象，导致假阴性病例增多。分子生物学诊断方法具有快速、灵敏、特异、直观等特点，可以直观地从分子生物学水平检测到病原核酸的存在，对于结核菌的研究和诊断同样具有独特的意义。本项目筛选出稳定性、敏感性和特异性高的分子诊断标志物，并用筛选获得的标志物来建立快速、高效的实验猴结核病诊断方法，具有重要的理论和现实意义。

    2. 技术原理及性能指标：： 2.1 普通PCR方法 以结核分枝杆菌保守基因作为结核病诊断的分子标志物候选基因，进行评价，包括：（1）结核分枝杆菌IS6110插入序列；（2）16SrRNA和16S~23SrRNA转录间隔区（ITS）；（3）结核分枝杆菌H37Rv基因RD-1区（Rv3871～Rv3879c）、Ag85b、38-kDa、MPT63、MPB64L、14-kDa、19-kDa、hsp65等蛋白编码基因；（4）结核分枝杆菌保守基因gyrB。 累计对17个基因进行检测，共设计23对引物，显示检测自然感染结核菌阳性猴组织（肺脏、肺门淋巴结、肺外有病灶的组织）中的DNA具有极高的敏感性，但是对血清样本的检测敏感性不足。 2.2 多重PCR方法 根据不同基因扩增片段大小和反应条件，设计了2组多重引物组合，分别为组合1（Rv3875与IS1081）、组合2（IS6110、IS1081与Rv0934）。PCR反应条件与普通PCR一致，多重引物浓度之间的比例为1:1。检测效能与普通PCR一致，优势在于减少了PCR反应次数。 2.3 Real-time PCR方法 2.3.1 基于IS6110的Real-time PCR 基于IS6110基因设计了扩增78bp片段的引物和探针，建立的Real-time PCR法，证实可以检测出血浆中循环DNA的拷贝，具有一定的临床应用价值。 2.3.2 基于ESAT-6编码基因（RD-1）的Real-time PCR 针对ESAT-6编码基因，设计了一对引物和探针，建立建立的Real-time PCR法，证实检测血浆中ESAT-6编码基因效能差，提示血浆中结核菌ESAT-6编码基因浓度极低，不适宜作为检测猴结核病的样本来源，容易导致漏检。

     3. 技术的创造性与先进性 3.1 项目建立了基于实验猴血清、组织样本的普通PCR法、多重PCR法和Real-time PCR方法，并优化了PCR反应体系，弥补了国内研究的不足，具有一定的先进性。 3.2 项目通过人工感染模型、自然感染病例和健康实验猴样本，系统评价20余种候选结核分枝杆菌分子标志物的诊断效能，筛选出基于IS6110插入序列的敏感标志物（123bp中的78bp片段），在国内为首次研究。

     4. 技术的成熟程度，适用范围和安全性 4.1 检测技术相对成熟 基于项目组此前建立的结核病模型以及收集到的大量自然感染结核猴血浆和组织样本，建立和评价了实验猴结核病分子诊断方法，验证具有较高的临床应用价值。 4.2 适用范围 由于外周血循环DNA含量极低，建立的检测技术部推荐用于外周血、血浆及血清样本的检测，适用于组织、病料、鼻咽拭子等样本的检测。 4.3 安全性 检测方法安全，但是考虑生物安全因素，样本处理、抽提等环节应在生物安全柜内操作，PCR电泳等操作宜在负压环境操作。

    5. 应用情况及存在的问题：指以及所存在的问题。 5.1 应用情况 建立的检测技术初步用于少量实验猴的检测，特异性较高。 5.2 实验猴检测市场尚未打开 由于国内实验猴的存栏量远不如啮齿类动物多，筛选到结核病阳性有效样本量不大，加之多数实验猴饲养场管理人员担心影响销售，不愿对外泄露本场的检疫信息，导致资源的流失。 5.3 实验猴结核病快速诊断研究仍需持续开展 尽管目前实验猴的生产管理有了非常大的改善，基本实现了生产繁育的相对封闭，使得外源性疾病减少，但是结核病的感染始终没有根除，并且一直威胁着实验猴。所以，对其实验猴结核病快速诊断的研究需要持续开展。建议有关部门继续给予支持，以使该研究继续深入和推广应用。

    6. 历年获奖情况：指项目研究过程中所获奖项的情况。 2013年，“结核菌感染免疫的特征和调节机制及其在临床诊断中的应用”获得广东省科学技术奖励二等奖（B13-0-2-02）。