一、课题来源与背景 1.来源：广东省科技厅工业高新技术领域项目，项目编号2015A010107009； 2.背景：随着现代生物技术发展，家蚕生物反应器成为生物表达的重大进展之一，人和动物的传染病中，已有多种病毒的保护性抗原基因在其中成功表达。口蹄疫是危害较大的侵害养殖业的一类动物疫病，目前常用口蹄疫疫苗多为灭活疫苗，成本高还具有潜在生物安全危险。

    二、研究目的与意义 通过分离野生杆状病毒BmNPV构建表达载体形成家蚕幼虫生物反应器并对口蹄疫保护性抗原基因VP1进行表达，为口蹄疫基因工程多肽疫苗的研制奠定基础。

    三、主要论点与论据： 论点：成功构建家蚕幼虫生物反应器并对口蹄疫病毒保护性抗原VP1基因进行表达。 论据： 1. VP1基因的克隆：用PCR扩增方法构建C基端添加6×His标签的VP1基因克隆，目的基因大小为663bp左右。 2.真核转移载体的构建：转移载体pFBDM-VP1-eGFP的构建：用SacⅠ和HindⅢ对VP1及pFBDM进行双酶切，回收后用T4连接过夜，产物转化TOP10感受态细胞，Amp/Gm平板筛选。挑单菌落到含Amp/Gm的LB培养，对挑取的样品进行菌液PCR和双酶切验证。同样的方法，用SmaⅠ和XhoⅠ对绿色荧光报告基因eGFP和重组质粒pFBDM-VP1进行双酶切，连接、转化验证成功后，重组质粒命名为：pF-VP1-eGFP。 3.VP1基因表达重组杆状病毒的制备 3.1 VP1基因重组杆状病毒菌液的制备 asd缺失型rSw106-inv菌株应用于构建杆状病毒：将构建成功的转移载体pF-VP1-eGFP转化至提前制备的AcMultiBac/rSw106-inv感受态细胞中，通过Tn7转座，将VP1以及eGFP基因转座至杆状病毒AcMultiBac基因组上，成功获得含VP1基因的重组病毒菌液，命名为：Ac-VP1-eGFP。 3.2侵染蛋白介导的经济高效生产感染性重组病毒粒子 将Ac-VP1-eGFP与sf9细胞混合后，3d后观察荧光，病毒构建成功，命名为AcMNPV-VP1-eGFP。细胞培养物12000 rpm离心1 min，收集上清，作为P0代重组杆状病毒，连续传代3次，获得P1、P2、P3代重组杆状病毒，4℃保存。 利用相同的方法，通过Tn7转座构建重组菌株BmMultiBac-VP1-eGFP后侵染BmN细胞，进而产生重组病毒粒子BmNPV-VP1-eGFP。 3.3 TCID法测定重组病毒的滴度 重组病毒AcMultiBac-VP1-eGFP的滴度测定：病毒按照梯度稀释的方法获得10-1、10-2直至10-9浓度的病毒稀释液。将稀释后的病毒液以100 µL每孔对应加入96孔板中，72h后观察荧光，统计荧光孔数，按照TCID50方法计算病毒滴度，距离比例=（87.5-50）/（87.5-12.5）=0.5；lg（TCID50）=-5+0.5×[(-7)-(-5)]=-6；TCID50=10-6，即接种100µL稀释106倍的病毒液，可以使50%的Sf9细胞发生病变。 同法，测定重组病毒BmMultiBac-VP1-eGFP的滴度。 3.4 VP1基因在sf9细胞及BmN细胞中的表达检测 Sf9细胞表达：将AcMultiBac-VP1-eGFP重组P3代病毒感染Sf9细胞表达VP1蛋白。28℃，40 rpm/min转瓶培养Sf9细胞，当细胞密度达到1.0×106/mL左右时，根据2.5.3中测得的滴度，接入MOI=3的病毒，感染72 h后收集悬浮细胞液，4℃ 1500 rpm离心30min分别收取沉淀和上清。所得沉淀用适量的含1mM PMSF和0.1%Triton的预冷的PBS重悬，冰上放置30min，4℃12,000rpm离心30min，弃沉淀，上清即为细胞内蛋白。 Western-blot检测：用鼠源His-tag单抗抗体作为一抗，山羊抗鼠作为二抗，检测VP1蛋白在Sf9和BmN细胞中的表达情况。结果显示，Sf9和BmN细胞感染重组病毒后，表达的目的蛋白含有His标签，且表达的蛋白主要存在于细胞内，上清中存在的部分目的蛋白一方面是由于处理细胞的过程中，细胞破裂导致目的蛋白释放到上清中。另一方面，细胞在感染病毒72 h之后，会有部分细胞自动裂解而将目的蛋白释放到上清中。

    四、创见与创新： 依靠新型高效多基因杆状病毒表达系统作为表达工具，其本身在表达上具有效率高，表达量高，省时省力等特点。其中包含了利用零背景Tn7转座菌株构建重组Bacmid，构建了一种不依赖于转染试剂将重组杆状病毒DNA（Bacmid）介导进入昆虫细胞内，从而获得重组病毒粒子的方法。该方法不需要借助磷酸钙或者脂质体转染，不需要提取和纯化Bacmid DNA，只需要将携带重组Bacmid并表达侵染蛋白（invasin）的DAP（二氨基庚二酸）营养缺陷型大肠杆菌rSW106和昆虫细胞按一定的比例直接混合，就可以获得完整的感染性重组杆状病毒粒子。实验证明该方法生产重组病毒的效率为常规脂质体的5倍，从细菌到病毒一步到位，省去了重组Bacmid的提取、纯化精制、Bacmid DNA与转染试剂的混合等复杂的转染程序。

     五、社会经济效益及存在的问题： 1、项目取得的社会效益（主要指项目成果推广应用情况） 本研究直接研究成果仅在实验室进行试应用，尚未研制出成熟的产品进行临床推广应用。因此尚未产生明显的社会效益。 2、项目取得的经济效益 本研究直接研究成果仅在实验室进行试应用，尚未研制出成熟的产品进行临床推广应用。因此尚未产生明显的社会效益。 3、存在的问题、解决措施及建议 项目目前取得较好的研究阶段性成果，可以加大投入进行进一步对基因工程疫苗的研究。

     六、历年获奖情况： 1、“猪口蹄疫综合防制技术”获广东省科学技术奖励二等奖； 2、“华南地区猪口蹄疫免疫方案的推广与应用”获广东省农业技术推广奖二等奖。