一、课题来源与背景。 项目名称：猪等孢球虫qRT-PCR定量检测方法的建立及应用； 项目来源：广东省科学技术厅科技发展专项资金（协同创新与平台环境建设专项）； 项目编号：2016A040403079 承担单位：广东省农业科学院动物卫生研究所 项目背景：我国的母猪存栏量占全球50%以上，稳居全球第一位，是全球最大的养猪市场和猪肉消费市场。猪球虫病可引起仔猪严重腹泻甚至死亡，其仔猪发病率可高达50%-75%，死亡率高达75%，严重危害养猪业发展。目前国内外学者通过荧光显微镜等传统粪便镜检技术，以及普通PCR等分子生物学技术对不同国家、地区的仔猪进行病原检测，发现近50%仔猪腹泻是由等孢球虫引起，提示该病严重危害养猪业的发展。但传统的粪便学检测技术容易出现假阳性或假阴性的检测结果，特异性和敏感性有待提高，普通PCR 诊断技术无法定量分析球虫病的感染情况，因此新一代特异性、敏感的定量检测技术有待开发。鉴于此，本项目拟建立猪等孢球虫qRT-PCR定量检测方法，对临床样品进行检测以评价应用效果，既可提高猪等孢球虫检测敏感性，又可做到定量分析的效果，将为猪球虫病爆发风险评估提供理论依据，对进一步有效防控猪球虫病具有重要意义。

    二、技术原理及性能指标。 本成果利用生物信息学及分子生物学技术扩增获得Is-18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S rRNA序列，筛选探针引物，优化反应条件，建立q-PCR定量检测方法，通过对临床样品的检测，评价检测方法的应用效果。本技术的研究，需要进行q-PCR Marker基因的筛选、克隆；探针的筛选，标准曲线的建立及反应条件的优化；q-PCR定量检测技术敏感性、特异性的分析；最后用于临床样品的检测评估。该技术方法的建立，既可提高检测敏感性，又可做到定量分析的效果，对进一步有效防控猪球虫病具有重要意义。 本技术成功建立高敏感性、高特异性猪等孢球虫q-PCR定量检测方法，可以特异性检测到粪便样品中的单个卵囊，较传统检测方法：既可提高检测敏感性，又可做到定量分析的效果。

    三、技术的创造性与先进性 。本技术1）根据Genbank上Is 18S rRNA基因全序列（U97523.1）及Is ITS1基因序列（LC085519.1），利用Genome walking技术克隆首次获得Is-18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S rRNA 基因全长序列；2）利用生物信息学及分子生物学技术筛选获得IS-ITS2序列作为Marker基因，分别优化扩增引物（100nM）及探针浓度（100nM），成功建立q-PCR定量检测方法，通过敏感性及特异性检验，证实该方法可以特异性检测到样品中的单个卵囊，较传统检测方法既可提高检测敏感性，又可做到定量分析的效果；3）本项目检测方法的建立在临床检测中进行了应用，并详细分析了猪场等孢球虫病的流行情况，为猪球虫病爆发风险评估提供技术支撑和理论依据，对养猪业的发展具有重要意义。

    四、技术的成熟程度，适用范围和安全性。 本技术已在广东粤东、西、北、珠三角地区等多家大型猪场进行应用，并获得良好效果。目前适合在全国各种类型的猪场进行推广运用。针对母猪和仔猪腹泻严重区域猪场，可重点推广。

    五、应用情况及存在的问题。 本技术通过技术推广、申请专利和发表论文等多种方式，进行项目成果的运用推广。现已在广东粤东、西、北、珠三角地区多家大型猪场进行样本采集及检测运用。通过与常规的检测方法（麦克马斯特法、普通PCR检测法）进行对比，大大提高了检测效率和准确性，给猪场提供了猪等孢球虫感染风险评估依据，提前做出了防控措施，减少了发病损失，取得了一定的经济效益。下一步需进一步加大应用推广力度，尚需加大在临床应用推广方面的经费投入。

    六、历年获奖情况。 暂无。