| 介绍: |
本项目“副猪嗜血杆菌hhdA基因无抗性标记缺失菌株的构建及初步应用”，课题编号：2013B020307002，项目合同经费：8万元，经费来源：广东省科学技术厅。副猪嗜血杆菌是规模化养猪生产中保育阶段仔猪重要的细菌性病原，对该病原的相关防控技术研究和致病机制还不清楚，利用相关技术获得副猪嗜血杆菌基因缺失菌株是进行相关研究的重要技术手段。同源重组是自然界中最重要的重组方式，利用该技术已在相应的病原菌中揭示了大多数可疑基因的功能，并获得了基因缺失疫苗应用菌株。但同源重组技术在副猪嗜血杆菌方面的应用还存在争议和难度：国外相关研究发现副猪嗜血杆菌具有一个cAMP依赖性自然转化系统，能够摄取含有ACCGAACTC序列信号肽（USS）的DNA，在改进诸如cAMP浓度、DNA浓度和外源DNA的曝光时间等参数后，构建了一个含有卡那霉素抗性基因标记的thy基因缺失突变菌株。国内相关技术专家利用该技术虽构建了副猪嗜血杆菌相应基因的缺失菌株，但所构建的基因缺失突变菌株都是利用抗性基因来替代目的基因。从而根据突变菌株表型的变化来验证某种基因的功能不太确切，因为细菌的自身机能代谢调控是相互作用相互依赖的，这种突变菌株的某些表型变化有可能是受插入抗性基因的影响，而非目的基因的缺失引起。另外用抗性基因作为筛选标记获得的弱毒免疫保护菌株，由于抗性基因的存在，从生物安全的角度考虑，阻碍了该基因缺失突变菌株作为疫苗用菌株的应用。副猪嗜血杆菌hhdA基因是副猪嗜血杆菌潜在的毒力基因，为了获得副猪嗜血杆菌hhdA基因缺失菌株，本课题组利用结合转移的方法依靠氯霉素抗性、营养缺陷型表型以及特异性序列PCR扩增等技术筛选获得了副猪嗜血杆菌hhdA基因无抗性标记缺失菌株。设计相应的引物扩增hhdA基因上、下游序列，重叠PCR将hhdA基因上、下游序列进行拼接，经相应酶切后构建自杀性质粒载体PEMOC2ΔhhdA。将E.β2155(pEMOC2ΔhhdA)和HPS血清5型野生型菌株在TSA（DAP、NAD）平板上培养一定时间后涂于TSA（CM、NAD）平板上，筛选鉴定到发生单交换的菌株。将发生单交换的菌株在含有蔗糖培养基平板上筛选鉴定双交换菌株时，发现本课题组分离的HPS菌株在相应蔗糖培养基平板上不生长。因此利用本课题组建立的有限稀释连续培养法筛选获得HPS血清5型野生型hhdA基因缺失菌株（HPSΔhhdA）。虽然构建了副猪嗜血杆菌基因无抗性标记缺失菌株，但技术筛选效率偏低，在同源重组第二次交换时需要大量的筛选工作。 |
