1. 课题来源与背景 课题来源：国家自然科学基金委员会；项目类型：面上项目；课题名称：海洋异壁放线菌中免疫抑制剂浅蓝霉素的生物合成研究；课题编号：31070045。 课题背景： 海洋微生物已成为活性先导化合物的新源泉。海洋微生物活性物质往往具有独特、新颖和复杂的化学结构，为发掘新颖酶学机理和学习天然生物合成机制提供了很好的材料。浅蓝霉素家族抗生素具有独特的二联吡啶环结构，很有潜力被开发成为新型免疫抑制剂。我国自主分离的海洋异壁放线菌Actinoalloteichus sp. WH1-2216-6能生产8种浅蓝霉素类化合物，包括三个新化合物浅蓝霉素F,G 和H，本研究拟以浅蓝霉素主要研究对象，开展生物合成机制研究。

    2. 研究的目的和意义 浅蓝霉素家族是一类十分具有潜力的药物候选物，特别是作为新型的免疫抑制剂正在进行成药性评价。目前对于浅蓝霉素的生物合成基因簇的克隆和功能尚无报道。本研究拟对浅蓝霉素的生物合成基因簇进行克隆和鉴定，并对其相应的生物合成基因进行体内和体外功能研究，阐明其生物合成途径，特别针对浅蓝霉素的独特骨架二联吡啶环的生物合成和脱氧糖基的生物合成进行研究。以此为基础，通过组合生物合成技术获取新的结构类似物并进行相应的生物活性筛选。

    3. 主要研究结果： 从浅蓝霉素生产菌株海洋异壁放线菌Actinoalloteichus cyanogriseus WH1-2216-6中成功克隆到了44.6kb的浅蓝霉素A生物合成基因簇，实现了该基因簇在Streptomyces coelicolor YF11中的异源表达。生物信息学分析显示该基因簇包含24个开放阅读框，其中有20个可能和浅蓝霉素生物合成相关，包括参与转运调节的基因5个，吡啶环合成基因7个，后修饰基因8个。我们对其中的11个基因进行了体内基因敲除研究。结果表明:（1）CrmC、CrmD、CrmE参与了第一个吡啶环的形成，CrmD和CrmE基因敲除突变株都丧失了产生浅蓝霉素A的能力。在CrmD基因敲除突变株喂养吡啶甲酸恢复了浅蓝霉素A的生产能力，证明第一个吡啶环前体来源于吡啶甲酸，由赖氨酸起始合成；（2）通过基因敲除验证CrmA、CrmB、CrmI和CrmJ可能参与第二个吡啶环的形成，CrmA为聚酮和非核糖体肽合成酶杂合蛋白，CrmB为非核糖体肽合成酶，说明第二个吡啶环由PKS/NRPS杂合途径形成；（3）CrmA和CrmB在浅蓝霉素的生物合成中可以添加两个氨基酸，从浅蓝霉素的结构推测只要添加一个氨基酸，从氨基水解酶crmL突变株中分离鉴定到一个新的代谢中间体蓝霉素L，即在浅蓝霉素骨架结构的基础上增加了一个亮氨酸，通过生化实验证实可CrmL水解掉亮氨酸，阐述了一种次生代谢产物合成途径中保护/去保护机制；（4）从单加氧酶CrmH突变株中分离鉴定到代谢中间体浅蓝霉素N及副产物浅蓝霉素J，体外酶学证明CrmH为二元组分单加氧酶，可由多个还原酶供氢，最终可产生两个终产物和3个非酶催化产物；（5）对浅蓝霉素产生菌株优化发酵条件，分离鉴定了10个浅蓝霉素家族同系物。 通过本项目的研究，我们成功获得了浅蓝霉素A的生物合成基因簇，通过体内基因敲除和体外酶学研究，得到了10个浅蓝霉素相关的代谢产物，其中7个为新化合物；阐明了浅蓝霉素代谢途径中保护/去保护机制；首次发现和证明了二元组分单加氧酶催化肟基形成机制，优化发酵条件，分离鉴定了10浅蓝霉素家族同系物。本项研究成果发表在《Journal of the American Chemical Society》，《Organic Letters》，《Journal of Natural Products》，《微生物学报》，《中国抗生素杂志》上。

    4. 创见与创新： （1）首次阐明二元组分单加氧酶催化肟基生成机制； （2）鉴定浅蓝霉素代谢途径中氨基酸添加/去除的保护机制。

    5. 存在的问题： 本项目顺利达到了预期目标，但本项目中还存在着一些问题：（1）本项目克隆到了浅蓝霉素A的生物合成基因簇，但在浅蓝霉素D结构中糖合成相关的基因并没有和浅蓝霉素主体合成基因簇聚在一起，给糖合成相关基因的鉴定造成了难度；（2）一些突变株中产生的的浅蓝霉素类似物的结构不太稳定，在常温下容易降解，需要多次分离纯化才能够确定结构；（3）部分浅蓝霉素生物合成酶在大肠杆菌中不溶解，限制了酶的生化性质研究，如羟化酶CrmF，醛基合成二元组分酶CrmN/CrmO等。

    6. 历年获奖情况： 2012年获得“全国优秀科技工作者”称号。