一、课题来源与背景。

1、项目在国家自然科学基金青年基金的支持（专项经费27万元，编号31101271）下开展。

2、立项背景分析：由于胃肠黏膜屏障在SIRS（全身炎症反应综合征）发生及演化成MODS（多器官功能障碍综合征）过程中所起的重要作用，在早期肠内营养支持（特医食品）过程，给予含有胃肠道黏膜保护与修复作用活性成分的肠内营养支持，是目前防治MODS的重要方法和研究热点之一。但目前可临床应用的有效活性物质种类不多，且大部分机理尚在研究过程中。因此，研究发掘新的更优越的有效物质，并通过动物模型揭示其对胃肠道黏膜屏障的影响及作用机理，从而为肠内营养支持能更有效地保护胃肠黏膜屏障提供理论和技术支持，对阻断或者降低胃肠道屏障损伤对SIRS和MODS贡献具有重要的意义。在目前特医食品市场份额被国外品牌占据90%以上的市场环境下，自主知识产权特医食品的研制开发显得尤为重要，对保障国民健康和促进我国自主品牌产业突破重围，打破国外品牌垄断，具有重要的意义。在前期的研究中，我们发现了牡蛎酶解总肽为主要功能成分的肠内营养制剂能增强免疫抑制小鼠的细胞免疫活性和NK细胞活性，促进小肠的消化吸收功能，维持小鼠的正常生理功能，能有效缓解营养不良和胃肠功能障碍。本项目是在已有对牡蛎酶解活性肽免疫调节和胃肠功能方面研究的基础上，首次开展牡蛎活性肽成分在胃肠黏膜屏障保护与修复功能及其作用机理方面的研究。项目如得以顺利完成，将可初步获得牡蛎活性肽的成分及结构信息，以及对胃肠黏膜屏障保护与修复功能及可能的作用机理。

二、研究目的与意义：胃肠黏膜损伤可引发可致命的内毒素血症及多器官功能障碍综合征。含胃肠屏障保护作用物质的早期肠内营养支持是重要的临床治疗方法之一。但现可利用活性物质种类少，且非特效，是限制该治疗途径的瓶颈。前期研究显示药食两用海洋贝类-牡蛎，其蛋白酶解肽具促进胃肠道功能和免疫调节作用，但具体活性物质结构和功效信息尚待阐明。因此，项目以大鼠肠上皮细胞体外增殖模型为快速活性筛选手段，结合超滤和现代色谱等技术手段追踪分离牡蛎活性肽，利用蛋白质组学手段分析其组成和结构；以IEC-6(大鼠小肠隐窝上皮细胞株)、RAW264.7（小鼠腹腔巨噬细胞株）和小鼠T 淋巴细胞等建立体外活性筛选评价模型，研究了香港巨牡蛎肉不同酶处理产物及分离纯化肽组分对多种细胞活性模型的作用效果，分析其作用机制。

三、主要的论点与论据：目目前获得以下主要研究结果：

（1）分离获得对肠黏膜上皮细胞有促进迁移和增殖修复活性的牡蛎活性肽组分。牡蛎肉优选胰蛋白酶水解，超滤获得的<10k Da组分显示出明显促进IEC-6 细胞株迁移和增殖作用，在预给药培养4 天并在造模后继续给药模式下，造模8 小时后即显示出明显的促进作用，400 μg/ml给药浓度下，迁移面积达空白对照组的2 倍；超滤组分还表现出降低模拟缺氧状态IEC-6细胞株TNF-α表达水平，在500μg/ml较高浓度下较I/R模型组下降了40 pg/ml水平，显示出促进受损肠黏膜上皮细胞迁移修复，以及在缺血-再灌注损伤过程炎症抑制作用。

（2）获得免疫调节作用牡蛎活性肽组分。胰蛋白酶水解产物及超滤分离肽组分可促进RAW264.7 细胞吞噬能力，当<10k Da组分剂量为800μg/ml 时较空白组吞噬率上升23.99%；当剂量为800 μg/ml 时下调LPS 致RAW264.7 细胞分泌NO 水平，最大下调率为达到57.24%，显示出一定免疫调节和抗炎作用。

（3）追踪获得牡蛎活性肽并鉴定获得其氨基酸序列信息。利用反相高效液相色谱分离技术，对<5k Da牡蛎肽活性组分进行追踪分离纯化和表征，获得并鉴定了2条具有促进肠黏膜上皮细胞迁移和增殖修复作用活性肽序列（VAPEEHPVLL：MW, 1102.5872 Da；SYELPDGQVITIGNER：MW, 1789.9247 Da）。所获得的2条活性肽在LPS存在条件下，对肠黏膜上皮细胞IEC-6仍分别保持150.81±12.34% (5 μg/ml)和151.73±12.28% (6.25 μg/ml)的增殖促进作用，显示出开发为肠黏膜保护功能食品的潜力。

四、项目创新：首次发掘获得具有肠黏膜上皮细胞促进迁移与增殖修复作用牡蛎肽组分，并从中鉴定获得2条活性肽序列信息。

五、项目成果和意义：项目在国内外期刊发表科研论文全文7 篇（SCI 收录1 篇），申报发明专利3 项（其中2 项已授权）。项目的研究结果初步揭示牡蛎肽在肠黏膜损伤修复和抑制炎症中的部分作用机制，并初步明确了牡蛎肽组分中含量较高肽类来源，为其应用于特殊病理期肠道黏膜屏障保护的功能食品和特殊医学配方食品，特别是癌症放化疗病人与术后病人的特医食品，提供了有价值的理论参考和支持。同时也为我国第一海水养殖贝类牡蛎的高值化利用提供的新的发展方向。