课题来源与背景： 该课题为国家重大科学研究计划“基因转录终止与蛋白质翻译新调控机制”项目之课题一“免疫器官发育及免疫应答过程中APA调控规律及生物学意义”。尽管APA在脊椎动物基因组里面是一种普遍存在的现象，并且在基因表达调控网络中起着重要的作用，然而人们对于APA的研究才刚刚起步。现在我们对于APA的生物学意义的了解还非常粗糙，少数的研究集中在胚胎发育、肿瘤和免疫上，然而这些研究也是非常表面化的，这可能是由于以前研究技术手段的局限。现在高通量测序技术发展日新月异，使得很多原来难以解决的问题可以通过测序的方法来研究。最近几年来对于APA的研究正是基于新一代高通量测序技术，人们开发了不同的方法从全基因组水平上研究APA的变化。

    研究目的和意义： 在全基因组水平上APA是如何适应外界环境的变化的？尤其是免疫器官（如胸腺）发育过程中是如何变化的？在免疫反应方面APA是如何调节细胞对抗原的反应的？本课题将系统的研究胸腺器官发育过程中APA的调控规律，并研究巨噬细胞对抗原刺激时APA的变化规律，从细胞信号转导角度寻找细胞是如何将外界刺激信号转导给APA调控的。我们可以率先描绘出免疫器官(如胸腺)在发育过程中及免疫细胞对抗原刺激的情况下APA的改变，鉴定出关键的基因及通路，揭示APA改变在这发面的生物学意义。

    主要论点与论据： 1）完成了小鼠胸腺发育8个时期及T细胞发育4个阶段(DN、DP、CD4、CD8)的mRNA 3'末端测序，分析了胸腺发育及T细胞发育过程中基因表达量及APA的变化，发现了：T细胞定居胸腺前后时期（E13.5-E15)，胸腺APA发生变化的基因在wnt通路中富集；Rag1基因在E13.5后3'UTR变长，可能和T细胞的重排相关；T细胞发育DN与DP阶段之间发生的APA变化的基因在细胞凋亡及P53信号通路中富集，可能与TCR的重排有关； 2）完成了T细胞分化为Th1细胞过程中3'末端文库的测序，发现T细胞分化后3'UTR变短，并发现了相关的APA调控关键基因（如STAT5B等）。 3）完成了巨噬细胞在LPS及病毒刺激前后的3'末端文库的测序，发现全基因组水平上平均3'UTR长度有逐渐变短的趋势，并鉴定了病毒感染后参与抗病毒信号转导及一些干扰素诱导基因，表明APA和基因差异表达两种机制相互协作共同维持抗病毒天然免疫过程的平衡状态。

    创见与创新： 1）开发了IVT-SAPAS高通量APA测序技术，该技术具有起始量低、成功率高并且可以快速并行构建过个文库；同时通过barcode的使用，我们可以在Illumina Hiseq 2500上进行测序，大大降低了测序成本；为了研究APA的生物学功能，我们实现了基于IVT-SAPAS技术研究不同长度3'UTR翻译效率的方法，我们还实现了cas9技术改变特定poly(A)位点的技术，从而可以在细胞或动物水平研究APA位点调控所导致的表型变化。 2) 应用IVT-SAPAS技术完成了人T细胞分化为Th1细胞前后的mRNA 3'末端测序。与naive T细胞相比，effector T细胞趋向于使用短的UTR，其中Th1细胞的平均3’UTR长度最短。我们发现了一些重要基因如STAT5B、CCND2等基因3'UTR在Th1细胞中变短。已有文献报道STAT5b能够促进Naive T细胞向Th1或者Th2分化。应用报告基因，我们发现STAT5B基因较短3'UTR翻译效率更高，同时我们发现SFRS9等RNA结合蛋白的表达量和STAT5B的APA调控有关。 3) 以VSV感染的人源和鼠源原代巨噬细胞为切入点，展开了病毒感染下全基因组APA的研究，观测到在病毒感染过程中，全基因组水平上平均3'UTR长度有逐渐变短的趋势，并鉴定了病毒感染后参与抗病毒信号转导及一些干扰素诱导基因。这表明APA和基因差异表达两种机制相互协作共同维持抗病毒天然免疫过程的平衡状态。当全基因组poly(A) 位点选择受到干扰后，细胞对病毒感染的敏感性发生改变，进一步证明APA在抗病毒反应中起关键作用。