1.课题来源与背景：本项目“副猪嗜血杆菌新型基因工程疫苗关键技术研究”，项目批准号：2014A010107020，项目合同经费：30.0万元，经费来源：广东省科学技术厅。副猪嗜血杆菌（HPS）是当前造成保育仔猪发病和死亡的主要病原，抗生素的滥用使该病原菌产生了严重的耐药性，用疫苗进行防控是最为经济有效的途径之一。但商品化的疫苗均为传统的灭活疫苗，内毒素存在于其中，免疫猪只后内毒素在猪体内释放造成损伤及免疫失败；另外疫苗中免疫保护性抗原成分含量较低，需免疫两次才能产生保护性抗体，且免疫后不能与野生病原菌进行区别。研制安全、高效以及能区别于感染菌株的疫苗成为发展趋势。

    2.技术原理及性能指标：内毒素是副猪嗜血杆菌外膜的重要组成部分，并且也是副猪嗜血杆菌重要毒力因子之一，类脂A是内毒素的主要毒性成分，类脂A的生物学活性与其分子结构密切相关，当类脂A的分子结构改变后，其毒力也将降低。本项目通过同源重组技术，将类脂A合成过程中的酰基转移酶LpxL基因进行缺失，使类脂A的结构发生改变，降低副猪嗜血杆菌的内毒素作用，减少疫苗的副反应。副猪嗜血杆菌的外膜蛋白P5在菌体表面具有较高含量，可产生较高水平的抗体，但所产生的P5抗体没有保护性；副猪嗜血杆菌的D15蛋白不但具有较高的免疫反应原性还有良好的免疫保护性，但在菌体中的表达量较低，导致传统的副猪嗜血杆菌疫苗需要免疫多次才能产生相应的保护效果。因此，本项目在获得LpxL基因缺失菌株的基础上，通过同源重组技术将P5基因用D15基因进行替换，获得内毒素毒性低、免疫保护性抗原含量高的菌株。为副猪嗜血杆菌安全、高效的基因工程疫苗研制奠定重要基础。

    3.技术的创造性与先进性：传统的副猪嗜血杆菌制苗用菌株利用原始的临床分离菌株，导致疫苗副作用大，免疫效果不佳。本研究将副猪嗜血杆菌类脂A合成过程中的酰基转移酶LpxL基因进行缺失，使类脂A的分子结构发生改变，降低内毒素的毒力，用LpxL基因缺失菌株作为疫苗用菌株可有效减少疫苗的副反应，提高疫苗的安全性。另外本研究通过同源重组技术，将副猪嗜血杆菌D15蛋白基因替换掉P5蛋白基因，实现副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原表达量增加，作为疫苗用菌株可提升疫苗品质，增强疫苗免疫效果。本研究相关研究技术和产品具有较好的创造性和先进性。

    4.技术的成熟程度，适用范围和安全性：本研究经过分子生物学技术的筛选和鉴定获得了LpxL基因缺失、D15蛋白基因替代P5蛋白基因的副猪嗜血杆菌工程菌株（HPS△LpxL△P5▽D15）。对基因工程菌株相关生物学特性的鉴定结果表明HPS△LpxL△P5▽D15菌株的生长特性同野生型菌株相似，利用扫描电镜对工程菌株HPS△LpxL△P5▽D15的形态进行了观察，与野生型菌株的形态相比无显著改变；HPS△LpxL△P5▽D15菌株对细胞粘附入侵能力与野生型菌株相比显著降低；HPS△LpxL△P5▽D15菌株感染实验动物造成的发病率和死亡率明显低于野生型菌株，用获得的HPS△LpxL△P5▽D15菌株制备疫苗免疫实验动物后可产生良好的保护效果，且免疫动物没有出现发热等不良反应，抗体检测结果表明HPS△LpxL△P5▽D15菌株免疫动物后不产生相应的P5蛋白抗体，但可产生高效价的D15蛋白抗体，HPS△LpxL△P5▽D15菌株所产生的免疫保护性效果和安全性明显高于野生型菌株。相关研究技术及方法较为完善和成熟，为副猪嗜血杆菌致病机制研究和安全高效疫苗的制备提供了重要帮助。

    5.应用情况及存在的问题：本项目虽构建了HPS△LpxL△P5▽D15菌株，并对基因工程菌株生物学特性进行了鉴定，但相关研究结果均建立在实验室研究阶段，缺乏相应的临床实际应用及效果评价，需要进一步加大产品的研制及临床推广应用。

    6.历年获奖情况：本项目相关研究内容处于初试研究阶段，暂未获得相关奖励。