①课题来源与背景：本项目“畜禽重要细菌病疫苗创制关键技术研究及产业化应用”来源于广东省科学技术厅，项目编号是2015B020230004，项目财政经费800.0万元。当前畜禽细菌性疫病感染率不断升高，疫苗的研发越来越受到重视，产业化需求不断加大。随着生物技术在兽医生物制品领域应用的不断深化，疫苗制造得到迅猛发展，产生了多种类型的疫苗，主要包括传统的灭活苗、弱毒苗及新型基因工程疫苗等。现有疫苗的研究重点均在其生产工艺改造、提高免疫效力和安全性的研究上，以提高疫苗的免疫保护效果，降低生产成本，改善疫苗安全性和使用性能。我国在疫苗关键技术研究领域仍存在许多薄弱环节，如疫苗抗原大规模培养、发酵工程、疫苗的工艺制作等技术与发达国家差距明显，产品质量也劣于进口产品。因此，针对细菌性疫苗创制及产业化的关键性技术有待深层次开发，系统技术有待进一步集成研究。

     ②技术原理及性能指标：利用细菌疫苗菌株的全自动生物反应器高密度发酵技术，优化了发酵条件，实现了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌及猪葡萄球菌灭活疫苗抗原快速、高效生产，提高了疫苗有效成分和疫苗效力。采用0.2μm微孔滤膜超滤浓缩的方法对副猪嗜血杆菌抗原进行了浓缩，相关研究结果表明浓缩前后副猪嗜血杆菌抗原的免疫原性没有改变。并利用低温高速离心等方法去除了副猪嗜血杆菌毒素及灭活剂，使疫苗质量更均一和优化。研究了超滤浓缩技术在副猪嗜血杆菌抗原浓缩中的最适条件，解决了目前多价多联灭活疫苗制备的难点，并将该技术应用到了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌及副猪嗜血杆菌多价灭活疫苗抗原的制备中。选出了合适的鸭疫里默氏杆菌弱毒疫苗保护剂配方：5%蔗糖+3%明胶组的冻干制品作为冻干保护剂基础配方，可获得的鸭疫里默氏杆菌活菌数为80%。摸索并优化了鸭疫里默式杆菌弱毒疫苗冻干工艺曲线，确保弱毒疫苗有效期内活力衰减最缓。以经典的同源重组技术为基础，构建了副猪嗜血杆菌LpxM基因无抗性标记缺失菌株，同时也构建了鸭疫里默式杆菌SRP基因缺失菌株和HmuY基因缺失菌株。建立以生物信息学及免疫蛋白质组学为基础的大规模高通量筛选技术，并对副猪嗜血杆菌相关抗原进行了克隆、表达和纯化，最终获得副猪嗜血杆菌13种重组蛋白，为副猪嗜血杆菌亚单位疫苗的研制奠定了重要基础。建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的ELISA检测方法，该检测方法特异性强，敏感性高，可用于临床样品的检测；建立了鸭疫里默式杆菌PCR-高分辨率熔解曲线的分子诊断技术可有效区分疫苗菌株和野生型菌株。建设细菌灭活疫苗生产线1条，本疫苗生产线可年产8000万毫升细菌性灭活产品。

     ③技术的创造性与先进性：科学地将该细菌病疫苗研发及生产技术有机结合在了一起，从而实现了畜禽细菌病疫苗创制关键技术的优化和升级，提升了畜禽细菌病疫苗研究与开发水平。突破了畜禽细菌病疫苗生产技术瓶颈的最关键步骤，对畜禽细菌病疫苗产业的升级和质量保障提供了重要帮助。利用抗原超滤浓缩技术，针对细菌病疫苗制备过程中不同抗原浓缩的最适条件进行了优化，突破目前畜禽细菌病疫苗多价多联灭活疫苗制备的难点。构建了副猪嗜血杆菌和鸭疫里默氏杆菌基因无抗性标记基因缺失技术，并对该缺失菌株的相关生物学特性进行了鉴定和分析，用基因缺失菌株制备疫苗免疫动物后获得了确切的免疫保护；同时以生物信息学及免疫蛋白质组学为基础的大规模高通量筛选技术，对副猪嗜血杆菌和鸭疫里默氏杆菌相关抗原进行了克隆、表达和纯化，制备亚单位疫苗免疫动物后获得了相应的免疫保护效果；相关研究将为副猪嗜血杆菌和鸭疫里默氏杆菌基因缺失疫苗和亚单位疫苗的研制奠定重要基础。

     ④技术的成熟程度，适用范围和安全性：已攻克副猪嗜血杆菌、猪传染性胸膜肺炎、猪葡萄球菌和鸭疫里默氏杆菌疫苗创制的新技术，并形成了新型畜禽细菌病疫苗研发技术体系与产业化技术平台，其中副猪嗜血杆菌灭活疫苗获得了新兽药注册证书和生产批文，鸭疫里默氏杆菌弱毒疫苗获得了临床批件，已改扩建疫苗生产线1条，获得了GMP证书。本研究相关产品和技术适用于畜禽细菌病防控，经过实验室检测和临床应用均获得了良好的效果。

     ⑤应用情况及存在的问题：本项目研制的相关产品和技术进行了临床的推广和应用，有效防控了相关病原的爆发和流行，减少了临床抗生素的使用，降低了养殖生产成本，带动养殖户增产增收，保障畜牧业的健康发展，相关产品和技术累计新增销售收入4278.65万元，累计新增利税2641.62万元，项目的实施内新增产值约2400万元，通过带动省内、国内企业和相关行业，实现了更显著的社会经济效益，在提高猪只的成活率和减少药物的使用方面所创造的间接收益约15400万元。同时也提高了我国动物食品卫生水平，减少了畜禽蛋肉制品中兽药的残留，保障了公共卫生安全。但猪葡萄球菌灭活疫苗目前还处在实验室研发阶段，没有获得相关批准文号，应加快相关产品及技术的开发和推广应用力度。