1、课题来源与背景： （1）课题来源 本课题来源于广东省科学技术厅，项目编号：2017A020211014，省级投入30万元。 （2）课题背景 癌症发病率基数大，发病率逐年上升。由于至今仍然没有彻底治愈的手段，死亡率仍在继续上升。治疗癌症药物市场需求异常旺盛，寻找高效治疗药物显得非常迫切与必要。 肿瘤干细胞具有自我更新的能力，在肿瘤的发生、发展、转移、入侵、抗治疗等方面都起到重要作用。一般的抗肿瘤药物只能延长病人生命，不能根除癌症，是因为这些药物只能杀死癌细胞，不能杀死具有抗治疗能力强的、能自我更新的肿瘤干细胞，存活的肿瘤干细胞又能生成新的癌症。CD44以及CD13、CD90、CD24、CXCR4、CD133、ABCG2和EpCAM等被认为是多种肿瘤干细胞的标记蛋白。CD44在大多数肿瘤组织中能够过表达，如白血病、胃癌、结肠癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、头颈癌、肺癌、膀胱癌等，CD44与肿瘤的发生、发展和凋亡有着密切的关系，是癌症靶向治疗的一个理想靶标。 当前，已经有一些研究采用抗CD44单克隆抗体用于抑制癌症细胞的增殖，例如，Marangoni等证明抗CD44的单克隆抗体P245能够抑制原发性乳腺癌肿瘤移植物在小鼠体内的生长。Zhang等证明抗CD44单克隆抗体RG7356能够在体外诱导慢性淋巴B细胞的凋亡，而且能够清除小鼠体内的慢性淋巴细胞白血病移植瘤。这些研究都是采用抗CD44单克隆抗体，是通过免疫小鼠获得，如果用于人体将导致人抗鼠抗体反应，需要开展耗时耗人力的抗体人源化工作。另外，这些抗体分子量大，对肿瘤组织和血管屏障的穿透性差，原核细胞表达易聚集沉淀，哺乳动物细胞表达量低，其细胞杀伤作用有限。为了克服单克隆抗体的这些缺陷和不足，此项目研究抗CD44的单链抗体。

    2. 技术原理及性能指标： （1）技术原理 CD44作为肿瘤干细胞的标记蛋白，在肿瘤的发生、发展、转移以及抗治疗过程中起到重要作用。CD44基因经常会发生选择性剪接，产生标准型（CD44s）和多种变异型（CD44v）。这些异构体与配体的相互作用，特别是透明质酸(HA)、骨桥蛋白(OPN)和基质金属蛋白酶(MMPs)，能够激活多个与致癌信号通路相关的细胞表面受体或域，如EGFR、c-Met、HER2、转化生长因子β受体1型（TGFβR1）和非受体激酶（Src家族）等，这将通过激活Ras、MAPK和PI3K/AKT信号通路以及促进化学抵抗、细胞运动和转移相关通路来促进肿瘤生长。通过抗体，靶向肽和适体，小分子抑制剂等阻断CD44 胞外受体与配体结合，可以治疗癌症。 单链抗体（scFv）是一种新型的基因工程抗体，由完整抗体的重链可变区和轻链可变区以及连接两者的短肽链组成，分子质量较小（30kDa），保留了完整抗体的抗原结合能力。由于单链抗体分子量小，具有组织穿透力强，在大肠杆菌中不易聚集和高表达，特异性和亲和力高以及免疫原性弱等优点，已被成功地用于临床前以及临床试验治疗多种癌症，具有很好疗效。在本研究中，采用scFv作为靶向CD44的抑制剂，阻断驱动癌症相关信号网络，从而治疗癌症。 （2）性能指标 性能指标包括抗体的表达水平、抗体蛋白的表达纯度及活性、抗体的药效和安全性。

     3. 技术的创造性与先进性： （1）肿瘤干细胞具有自我更新的能力，在肿瘤的发生、发展、转移、入侵、抗治疗等方面都起到重要 作用。一般的抗肿瘤药物只能延长病人生命，不能根除癌症，是因为这些药物只能杀死癌细胞，不能杀 死具有抗治疗能力强的、能自我更新的肿瘤干细胞，存活的肿瘤干细胞又能生成新的癌症。CD44是肿瘤干细胞的标记蛋白，采用抗CD44抗体用于肿瘤治疗可能杀死肿瘤干细胞，从而达到根除癌症的目的。 （2）传统的单克隆抗体分子量大，在制备和应用上受到限制。单链抗体分子量小，具有可溶性好，易 在大肠杆菌中表达，不易聚集，组织穿透力强，稳定性高，特异性和亲和力高，免疫原性弱等优点。目 前，仍未见到有关抗CD44单链抗体的报道。 （3）我国通过细菌发酵工艺的抗体表达水平低，我们将进一步优化抗体高效表达技术，将对细菌发酵 工艺进行优化，提高细菌密度和抗体表达量。

    4. 技术的成熟程度，适用范围和安全性： 本项目前期工作采用噬菌体展示技术筛选抗体文库，已经成功地分离了抗CD44的 人源单链抗体 CD44-207，前期研究表明此抗体能有效地抑制胃癌细胞增值以及在体内显著地抑制胃癌肿瘤的形成。在此基础上，本项目开展了抗体菌株发酵工艺的建立及其优化，抗体纯化工艺的建立及其优化，抗体的药学、药效、毒理和药代研究。 （1）最终优化了菌株发酵表达CD44-207的关键技术，提高了抗体的表达量; （2）已经完善了相应的抗体生产和纯化技术，提高了目的蛋白的表达纯度; （3）研究了抗体CD44-207的药效、药代、毒理学的临床前研究，研究表明CD44-207能够显著地抑制癌细胞的增值以及抑制小鼠体内的肿瘤生成; （4） 申请发明专利5项，获得了授权发明专利3 项，发表2篇 SCI 论文(A1 类二区)。

    5.应用情况及存在的问题： 未应用。

    6. 历年获奖情况： 未获奖。