课题来源与背景: 本科题来源2011年国家自然科学基金项目。

   研究目的与意义：本研究通过比较外周血和病灶区ABCB1基因的表观遗传差异；用BSP法和RT-qPCR观察祛瘀法降低甲基化而调控基因水平的能力；用罗丹明外排试验检测P糖蛋白的活性；并且从细胞染色、基因表达、免疫组化、组织病理几方面实证祛瘀法对MSCs的成骨保护作用和大鼠模型中预防激素性骨坏死的作用。研究围绕ABCB1基因启动子甲基化和基因表达水平展开。探讨激素性骨坏死发病的表观遗传机理，以及祛瘀法预防骨坏死的作用机制，对于提高临床诊疗水平，实现中医辨证论治的客观化、规范化具有重要的理论意义和应用价值。

   主要论点与论据：糖皮质激素引起股骨头坏死的发病机制尚未完全清楚，现已知激素在体内吸收和细胞内外的分布主要受到P-糖蛋白的调解。本项目组的前期工作显示，编码P-糖蛋白的基因ABCB1异常表现与激素性骨坏死的发生以及瘀证表现相关。这提示临床常用的祛瘀法有可能通过调控ABCB1基因而防治激素性骨坏死。

   创见与创新：祛瘀法的药物采用我们自主研制的木豆叶提取物制剂，是我科袁浩教授在筛选民间验方的基础上潜心研究而成，已在临床应用20余年，木豆叶提取物具有活血健骨、化瘀止痛的作用。

   社会经济效益，存在的问题：在第一部分临床研究中，我们前期研究发现，ABCB1 的基因多态性可能是激素性股骨头坏死的危险因素之一。大量研究表明，DNA 甲基化能引起染色质结构、DNA 构象、DNA 稳定性及DNA 与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。但是，ONFH 是一种多因素致病的复杂疾病，单一基因的甲基化难以揭示该疾病发生发展的普遍规律，因此我们在原课题基础上，利用高通量测序技术，构建ONFH 全基因组甲基化谱，寻找特异性差异位点，为后续研究提供新的方向。另外，由于股骨颈区BMSCs 提取困难，骨坏死患者的取材改为外周血。现代高通量测序技术为全基因组启动子甲基化的研究带来了便利，课题组及时申请了研究计划变更并获得批准。
    在第二部分细胞实验中，因为近年来有关激素性股骨头坏死的发病机制主要针对BMSCs 活性开展研究。以往研究发现激素性股骨头坏死患者BMSCs 成骨能力减弱、成脂肪分化能力增强可能是主要原因之一。因此，在实际实施过程中，我们先进行了第三部分的动物实验研究，采用了兔激素性股骨头坏死模型，提取模型动物BMSCs 进行培养，研究病理状态下BMSCs 的活性变化以及祛瘀法的影响。下一步我们将研究激素性股骨头坏死患者BMSCs 活性变化影响骨代谢的机制奠定基础。
   在第三部分动物实验中，根据研究结论可以推测通络生骨胶囊可能在ABCB1 的mRNA 的上游过程对该基因的进行表达调控，是一种转录前调控，包括甲基化修饰、非编码RNA 等表观遗传学调控，活血祛瘀法可能对表观遗传起调控作用，这有待于我们下一步进行更加深入的研究。